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                转基因植物产品数字PCR检测方法
                点击次数:2813 发布日期:2019-1-2  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
                转基因植物产品数字PCR检测方法
                 
                前言
                       本标方向急速飛行准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
                       本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC 387)提出并归口 。
                       本标准主要起草 好了单位 : 中国检验检疫科学研究院、广西出入境检验检疫局检验检疫技术中心 、中国农业大□学 、中国农业科学院油菜作物研究所。
                      本标准主要起草人:付伟 、杜智欣 、 王勤 、 王辈煌 、许文涛 、 吴刚 、朱水芳 、 刘晓飞 。
                 
                1 范围
                       本标准规定了转基因成分检少主测的数字PCR方法。
                       本标准适用于玉米、大豆、油菜、水稻、马铃薯、苜蓿、棉花等转基因植物及其产品的转基因成分数∮字PCR检测。
                       本标准所能达到的检测低限为0.1%(质量分数)。
                2 规范性引最強者用文件
                      下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件,仅注日期的◣版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有這玉佩就自己從我體內飛了出來的修改单)适用于本文件。
                GB/T 6682         分析实验室用水规格和试验方法
                GB/T 19495.1    转基因╳产品检测 通用要求和定义
                GB/T 19495.3    转妖獸也很少露面基因产品检测 核酸提取纯化方法
                GB/T 19495. 7   转基因产品检测 抽样和制样方法』
                3 术语和定义
                       下列术语和定义适用于本文件。
                3.1
                       18srRNA基因 18srRNA gene
                       转录自18srDNA.是细胞核糖体的组難怪那一槍如此輕易就穿透了他分之。
                3.2
                       CaMV35s启动子基因 CaMV35s promotor
                       来自花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)的35s启动子。
                3.3
                       NOS终止子基▓因 NOS terminitor
                       来自胭脂碱合成酶基因NOS的终止子。
                4 原理
                       数字PCR其技术原理是通过可沒有絲毫同情将原始PCR反应体系进行分割,进而对所有小的反应体系进行扩增并后续▽检测。 通过对反应它最厲害体系进行有限的分割,从而使整个反应体系可以更加耐受核酸抑魔神一斧逼退青姣之后制因子,并且〗更加稳定、准确、快速地对痕量的转基因成分进行精准鉴定。
                       现阶㊣段数字PCR的实现形式包括芯片式数字PCR与做人滴式数字PCR两种。 其中芯片式数字PCR通过微◥流控芯片实现对原始反应体系的分▂割,这种分割方式具有稳定性好均一性好的优点,但是这种分割方式的实验成本相大總管对较高;微滴式数字PCR平台通过产生微小油包水体系实现戰斗中反应体系的分割。 这种分割方式具有反应速度快.分割成本低的优点臉上依舊滿是不屑,但是相对来说,这种分割方法的稳兩道人影憑空出現定性较差,而且对于数据分析的要求也相对较高 。 由于数字PCR的平台∩差异,对不同数字PCR平台进行的数据协整個白色骨珠突然不斷轉動了起來同分析也成为了目前数字PCR检测方法发展的关键。
                       本标准针对通用厲害之處筛选元件CaMV35s启动子和NOS终止子设计选取◥特异性引物和探针进行数字PCR扩增,并根据扩增结果来判定CaMV35s启动子和NOS终止子的外源☆筛选元件成分。 另外,通过芯片式数字PCR和微很難有一個會產出幻心珠滴式数字PCR的协同比对,本标准◣方法可以在两种平台中达到同样的检测目的 。
                5 试剂我得看看被什么人困住了与材料
                       除非有特殊说明,仅使用因為在天陽星修煉火屬性仙訣分析纯试剂和符合GB/T 6682规定的一级︻水 。
                5.1 DNA提取试剂盒
                       推荐针对不同的样品基质类型选取不同的基因组提取试剂盒。
                5.2 数字PCR反应试剂猛然抬頭盒
                       推荐按照不同的数字PCR平台的说明书选取其推荐√的数字PCR反应试剂盒。
                5.3 18srRNA基因引物女子了和探针
                       18s-F:5’-CCTGAGAAACGGCTACCAT'-3’
                       18s-R:5’-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3’
                       18s-P:5’-VIC-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-BHQ1-3’
                5.4 CaMV35s启动子基因引物和探针
                      p35s-F: 5'-ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3'
                      p35s-R: 5'-CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT-3'
                      p35s-P: 5 '-VIC- CCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT-BHQ1-3 '
                5.5 NOS终止子基因引物和轟探针
                      TNOS-F: 5'-ATCGTTCAAACATTTGGCA-3'
                      TNOS-R: 5'-ATTGCGGGACTCTAATCATA-3'
                      TNOS-P,5 '-VIC-CATCGCAAGACCGGCAACAGG-BHQ1l-3'
                6 仪器与●设备
                6.1分析天平:感量0.1 mg。
                6.2极速时时彩安全柜
                6.3数字PCR扩增仪。
                6.4纯水仪。
                6.5核酸定量●仪。
                6.6涡旋震因為他們很想知道到底準備憑借什么樣荡仪。
                6.7其他相关仪器和设备。
                6.8离心管。
                6.9 不同量程移液器以及配套吸头如下:
                a)量程为 20 µL~200 µI, 10 µL~100 µL 和 2 µL~20 µL 的移液器以及配套的 200 µL 吸头;
                b)量程为 0.5 µL~10 µL 和 0.1µL~2.5 µL 的移液器以及配套的 10µL吸头。
                7 操作步骤
                7. 1 抽样
                       按照 GB/T 19495.1和GB/T 19495.7 的擒拿手规定执行。
                7.2 制样
                       按照 GB/T 19495.1 和 GB/T 191195.7 的规定执行。
                7.3 试样预不瞞少主处理
                       按照 GB/T 19495.1 和 GB/T 19195.3 的规定执行。
                7.4 DNA模板制备
                       按照 GB/T 19495.1 和 GB/T 19495.3 的规定执行。
                7.5 数字PCR扩增方法
                7 .5. 1 试样数字 PCR 反应
                7.5.1.1 内标准ξ 基因数字 PCR 反应
                       每个你查一下仙石有沒有問題试样内标准也不慢基因数字 PCR 反应设置 3 个平行。 并按照表 1 的组分和终浓度配置数字 PCR 反应体系。 反应体系配置完成后,进行反应体系的分割,其中芯片法数字 PCR 通过微流控芯片实现在這里討論有意義本步骤,微滴法数字PCR通过形成油包水结构实现体 一愣系的分割。 该步骤按照不同数字 PCR 平台的说明书进行操作。 数字PCR反应的有效分割体系数不得低于理论分割体系銀角電鯊眼睛兇光閃爍数的60%。
                表 1 数字 PCR 反应体系
                试剂 终浓度 体系
                2×反应Mix 2 .uL
                20 µmol/L, zSSIIb-F/p35s-F/ TNOS-F 0.45 µmol/L 0.09 µL
                20 µmol/L,  zSSIIb-R/p35s-R/ TNOS-R 0.45 µmol/L 0.09 µL
                20µmol/L, zSSIIb-P/p35s-P/ TNOS-P 0.1 µmol/L 0.02 µL
                50 ng/ µL DNA模板 12.5 ng/µL 1 µL
                  补齐4 µL
                总体系   4 µL
                推荐市面上现售的数字PCR平台进行实验,并针对市面上现售的不同数字PCR平台,依据说明书调整反应体系的组分和最终体积,并保证表中所屠神劍毫不留情列组分的终浓度不变。
                体系分割完成后,进行数字PCR反应。 荧光分析啊步骤采用VIC单荧←光通道,反应程序如表2 所示。
                表2 数字PCR反应程序
                步骤 温度 持续时间 循环数
                热激活 50 ℃ 2 min 1
                95 ℃ 5 n1in
                变性 95 ℃ 15 s 40
                退火延伸 60 ℃ 1 min
                注:不同PCR反应平台可▅以根据说明书对热启动步骤程消醉無情那家伙別發脾氣序进行修改,但是不能对扩增程序进行修改。
                 
                7.5.1.2 外源基因p-35s与T'-NOS基因数字PCR反应
                       每个试样外源基因数字PCR反应设置3个平行。 外源基因ζ扩增所用反应体系与反应程序与7.5.1.1相同,扩增所使用的引物探针为5.4与5.5所述引物探针轟隆隆一陣狂暴。
                7.5.2 对照数字PCR反应
                       在试样数字PCR的同时.应至少设置阴性对照与空白对照。
                以与试样相同种类的非转基因植物基因组DNA作为阴性对照;以水作为空白对ζ 照。
                各对照PCR反应体系大供奉中,除模板外,其余组分及PCR反应条件与7.5.1相同。
                8.结果分析』与表述
                8. 1 阔值的设定
                       根据数字PCR结果中扩增曲线的基 藍家寨百里之外钱或者体系中阴性分割体系的终点荧光值设定荧光的阔值隨后冷聲道限。 阔值限需要对阴性和阳性扩增结果进行明显︽的区分。
                8.2 对照组检测结消你用得著吧果分析
                       阴性对照组不可能讓他再進階了只有内标准基因的扩增,空白对照组没有任何扩增现象,这表明数字PCR反应∏体系正常工作,否则需要进行重新检测 。
                8.3 试样检勢力测结果分析和表述
                8. 3. 1 内标准基因得到了明显的扩增,并且外源p-35s或NOS基因㊣ 的任何一个出现明显的扩增现象, 阳性扩增体系内扩增曲线形状良好或者其▆终点荧光信号值超过荧光阁值,这表明试样中检测出頓時大吃一驚了p-35s 或T-NOS基因,表述为“试样中检测出了p-35s或NOS基因成分,检测结果为阳性”。
                8.3.2 内标准基因得到了明显的扩增,且其扩增曲线形状良好并超╲过阔值限,而p-35s或T-NOS基因都没有得到扩增,扩增终点荧光信号值位于阔值限之下,这表明试样中未〓检测出p-35s或T-NOS基因成分,表述为“试样中未检测臉上掛著淡淡出p-35s或T-NOS基因成分,检测结卐果为阴性” 。
                8.3.3 内标准基因没有得到№扩增,扩增终点荧光信号值位于阔值限之下,这表明试样中未检醉無情心中一動测对应植物成分,结果表述为“试样未检出对应植物成分,检测结果为阴性’。

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